蓝小华推荐丨 J BIOL ENG：中链长γ-和δ-内酯从头生物合成的合成代谢途径
中链长度的 γ -内酯和 δ -内酯是存在于120多种食品中的强效芳香化合物。如水果、香精和香料。其中，产量最大且商业价值最高的内酯类化合物为 γ -癸内酯。这种物质单独存在时会散发出桃子与椰子混合的香气，是桃子、杏子和草莓等水果香气的重要组分。尽管如此，目前 γ -内酯和δ-内酯的天然生物合成途径尚未明确。
2025年11月25日，Jonathan Muller团队在Journal of Biological Engineering期刊上发表了题为“A synthetic metabolic pathway for the de novo biosynthesis of medium chain length γ- and δ-lactones”的研究论文。该研究通过工程化酶设计，构建了一条新型代谢途径，实现了内酯的从头生物合成，最终在大肠杆菌中成功生产出γ-癸内酯（3.53 mg/L）、δ-癸内酯（0.53 mg/L）、γ-十二内酯（1.21mg/L）及δ-十二内酯（3.29 mg/L）。
该研究阐述的内酯生物合成途径设计（图1）：
第一步：通过工程化酰基-ACP硫酯酶从脂肪酸生物合成中生成癸酸。
第二步：利用细胞色素P450 BM3在癸酸的C4或C5位进行羟基化。
第三步：羟基癸酸自发环合生成γ-内酯或δ-内酯。
图1: γ -癸内酯和 δ -癸内酯生物合成途径
该研究阐述的内酯酶工程改造过程：
1N端截短
对硫酯酶CvFatB1进行N端截短，共获得21种CvFatB1截短体（CvT1-T21）；采用醇类生物合成途径筛选产生醇类的CvFatB1蛋白截短体。其中，CvT5有最高的乙醇滴度（图2C）
图2: 筛选CvFatB1截短体
2 定点突变
采用定点突变的方式对硫酯酶CvT5进行酶工程改造。使用Phyre2服务器构建CvT5的结构模型，并通过PyMol进行可视化展示。通过氨基酸序列比对，成功鉴定出催化三联体结构,（图4A）其内部含有M90、W122和W140三个大型疏水残基形成的底物结合位点。将各位点进行定点突变，其中，CvT5 W122F突变体产生的癸醇滴度最高（222.5 mg/L）（图4D）；CvT5 W122G 突变体表现出最高的C10特异性（77.1%）（图4E）
图4: 工程化CvT5
3 BM3突变体优化
对BM3进行基因改造，分别引入V78A/双点V78A/F87A突变；L188 Q/L188Q 与I401P双突变；D182S、H266T及 A328V等一系列突变，成功获得多个突变体。其中，BM3 突变菌株F87G L188Q高产δ-癸内酯（图5D），BM3突变菌株 V78A F87A L188Q A328V高产γ-癸内酯（图5E）。
图5: 筛选BM3突变体大肠杆菌 ΔfadD 转化了表达 GFP 、BM3野生型或BM3突变体的质粒
4癸内酯的体内生物合成
选择高产癸醇的CvT5 W122F硫酯酶在大肠杆菌中合成癸内酯，将EcACP与CvT5 W122F通过同一质粒共表达。（图6A）实验结果表明，硫酯酶与BM3 V78A F87A L188Q A328V共表达时，γ－癸内酯滴度最高为3.53 mg/L；而与BM3 F87G L188Q共表达时，δ－癸内酯滴度最高为0.53 mg/L。（图6B）
图6: 大肠杆菌 ΔfadD 的癸内酯生物合成：将表达EcACP和CvT5 W122F的质粒与表达 GFP 或BM3突变体的第二个质粒转化至大肠杆菌中
5十二内酯的体内生物合成
将C12特异性（UcFatB1）的FatB1硫酯酶进行N端截短并筛选出最高产月桂酸的UcT4突变体，（图7B）将其与前述BM3突变体共表达。实验结果表明，硫酯酶与BM3 V78A F87V L188Q共表达时， δ -十二内酯滴度最高为3.29 mg/L，而与BM3 V78A F87V I263G共表达时，γ -十二内酯滴度最高为1.21 mg/L。（图7C）
图7: 大肠杆菌生物合成十二内酯
综上，此前从未有过以大肠杆菌为底盘菌进而从头生物合成内酯的报道，本研究首创了代谢途径，并成功在大肠杆菌中从头合成了包括δ-癸内酯、γ-癸内酯、γ-十二内酯和δ-十二内酯在内的中长链内酯，为未来研究提供了方向。
